We Włoszech trwa bezwzględna walka z terroryzmem. Pod przykrywką agencji dobroczynnej działa tajemnicza organizacja rządowa, która używa młodych dziewcząt-cyborgów do wykonywania mrocznych i niebezpiecznych misji. Kondycjonowane psychicznie i fizycznie, bohaterki muszą pogodzić swoje dziecięce emocje z brutalnym światem szpiegostwa i zabójstw.
Gunslinger Girl: Il Teatrino OVA przedstawia dodatkowe epizody eksplorujące uczucia i motywacje bohaterek, podkreślając ich trudną relację z opiekunami oraz własną tożsamością. Wśród nowych wyzwań i niebezpieczeństw w scenerii malowniczych pejzaży Wenecji bohaterki muszą stawić czoła nie tylko wrogom, ale także prawdzie o samych sobie. Tłem opowieści są atmosferyczne miejskie uliczki, kryjące mroczne sekrety, w których światło i cień mieszają się, podkreślając melancholijny charakter oraz filozoficzne przemyślenia stanowiące istotę tego dramatu akcji.
