We Włoszech, w cieniu pięknych miast i malowniczych krajobrazów, rządowa agencja społeczna pod przykrywką kliniki medycznej prowadzi specjalny program, mający na celu przeciwdziałanie terroryzmowi. Organizacja ta ratuje ciężko ranne i osierocone dziewczynki, przebudowując ich ciała przy pomocy zaawansowanych cybernetycznych implantów i poddając je rygorystycznemu szkoleniu, by stworzyć z nich skutecznych zabójców. Historie bohaterek, takie jak Henrietta, Triela czy Rico, ukazują dramatyczny kontrast pomiędzy kruchym światem dziecka, a brutalnością życia profesjonalnych morderców. Gunslinger Girl to seria o mrocznym, melancholijnym tonie, skupiająca się na emocjonalnych konsekwencjach manipulacji, utracie dzieciństwa oraz próbie odnalezienia ludzkiej tożsamości w świecie pełnym przemocy, obowiązku i moralnych dylematów.